Genetik araştırmaları yürütme sürecinde, örneğin küçük anatomik oral tümörleri, hatta tek hücreli örnekleri ve insan hücrelerinde çok düşük seviyelerde kopyalanan spesifik gen mutasyonlarının örneklerini incelemek için yetersiz RNA örnekleriyle sık sık karşılaşıyoruz.Elbette COVID-19 testi için, örnekleme sırasında sürüntüler doğru yerde değilse veya yeterli sayıda değilse, örnek boyutu çok düşük olacaktır, bu nedenle Sağlık ve Aile Planlaması Komisyonu iki gün önce çıktı ve testi geçti ve nükleik asit örnekleyici altı örnek almadıysa bunu bildirebilirsiniz.
Reaktifin duyarlılığı önemlidir çünkü şu veya bu sorunumuz var, peki RT-PCR'nin duyarlılığını artırmak için ne yapabiliriz?
Olası çözümleri tartışmadan önce, az önce bahsettiğimiz durumla ilgili iki büyük komplikasyondan bahsedelim.
Her şeyden önce, örneğimizde yalnızca birkaç hücre popülasyonumuz olduğunda RNA kaybı konusunda endişeleniyoruz.Kolon yöntemi veya nükleik asit çökeltme yöntemi gibi geleneksel ayırma ve temizleme yöntemleri kullanılırsa, birkaç numunenin kaybolma olasılığı yüksektir.Bir çözüm, tRNA gibi bir taşıyıcı molekül eklemektir, ancak o zaman bile, geri kazanım deneyimizin tamam olduğunun garantisi yoktur.
Peki daha iyi bir yol nedir?Kültürlenmiş hücreler veya mikroanatomik numuneler için iyi bir seçenek doğrudan lizis kullanmaktır.
Fikir, hücreleri 5 dakika boyunca bölmek, RNA'yı solüsyona salmak, ardından reaksiyonu 2 dakika durdurmak, ardından lizatı doğrudan ters transkripsiyon reaksiyonuna eklemek, böylece hiçbir RNA kaybolmaz ve son olarak elde edilen cDNA'yı doğrudan koymaktır. gerçek zamanlı reaksiyona.
Ancak, sınırlı bir başlangıç noktası veya az miktarda hedef gen ifadesi nedeniyle, tüm RNA'yı geri dönüştürebilir ve yine de iyi bir gerçek zamanlı sinyal elde etmek için yeterli şablon sağlayamazsak ne olur?
Bu durumda, amplifikasyon öncesi adım çok faydalı olabilir.
Aşağıda, ters transkripsiyondan sonra duyarlılığı artırmak için bir şema bulunmaktadır.Başlamadan önce, ön amplifikasyon için bu hedefler için özel primerler tasarlamak amacıyla hangi hedeflerle ilgilendiğimizi sormamız gerekir.
Bu, 100 çifte kadar primer içeren karışık bir primer ve 10 ila 14 kez reaksiyon döngüsü oluşturarak elde edilebilir.Bu nedenle, elde edilen cDNA'yı önceden çoğaltmak için bu gereklilik için özel olarak tasarlanmış bir Ana Karışım gereklidir.
Döngü sayısının 10 ile 14 arasında ayarlanmasının nedeni, bu sınırlı döngü sayısının çeşitli hedefler arasında rastgeleliği sağlamasıdır ki bu, nicel moleküler bilgiye ihtiyaç duyan araştırmacılar için çok önemlidir.
Ön amplifikasyondan sonra, büyük miktarda cDNA elde edebiliyoruz, böylece arka uçtaki algılama hassasiyeti büyük ölçüde gelişiyor ve hatta numuneyi seyreltebiliyor ve olası rastgele hataları ortadan kaldırmak için çoklu gerçek zamanlı PCR reaksiyonları gerçekleştirebiliyoruz.
Gönderim zamanı: 11 Nisan 2023